Osocze to pozbawiona elementów morfotycznych płynna część krwi stosowana jako samodzielny produkt leczniczy (osocze terapeutyczne) bądź surowiec do otrzymywania leków. Osocze zawiera setki białek pełniących ważne role w procesach fizjologicznych. Funkcja niektórych z nich pozostaje nadal nieznana. Podstawowymi białkami wykorzystywanymi w procesie frakcjonowania są albuminy i immunoglobuliny obecne w osoczu w stężeniach odpowiednio 35 g/l i 10 g/l. Stanowią one około 80% wszystkich białek osocza. Pozostałymi, bardzo ważnymi z punktu przemysłowego przerobu, są czynnik krzepnięcia VIII – kilka ng/l, antytrombina III – 300 mg/l oraz α 1- antytrypsyna – 1,5 g/l.

W ciągu ostatnich lat frakcjonowanie osocza przekształciło się w ogromny światowy przemysł. Produkowanych jest obecnie ok. 20 różnych preparatów białkowych, niezbędnych w terapii wielu chorób. Osocze, surowiec do ich wytwarzania, w 35% pochodzi z wirowania krwi pełnej, a w 65% uzyskiwane jest w procesie plazmaferezy. W procesie frakcjonowania przerabianych jest ok. 23-28 milionów litrów rocznie. Dokonuje się tego w ok. 70 różnej wielkości zakładach na całym świecie.

Do szybkiego rozwoju rozdzielania białek osocza na skalę przemysłową przyczyniły się przede wszystkim prace zespołu kierowanego przez E. Cohna opublikowane w 1946 roku. Zaproponowane techniki wytrącania i oczyszczania poszczególnych białek ulegały w kolejnych latach dalszym modyfikacjom i udoskonaleniom związanym ze zwiększaniem skali produkcji. Głównymi czynnikami fizykochemicznymi wykorzystywanymi w tym procesie są: stężenie alkoholu etylowego, pH, siła jonowa stosowanych odczynników oraz temperatura.

Nowoczesne frakcjonowanie osocza jest procesem prowadzonym z niezwykłą starannością, regulowanym przez szereg międzynarodowych przepisów, zaleceń oraz wytycznych. Zwalidowane, ściśle przestrzegane procedury dotyczące niszczenia lub usuwania jakichkolwiek patogenów, a w szczególności wirusów, są nieodłącznym elementem wytwarzania leków osoczopochodnych. Wszystko to ma na celu uzyskanie wysokiej jakości farmaceutyków, których bezpieczeństwo wirusologiczne będzie gwarantowane.

Wymagania dla materiału wyjściowego
Niezwykle ważną rolę w zapewnieniu najwyższej jakości i bezpieczeństwa leków osoczopochodnych odgrywa materiał wyjściowy. W związku z tym dużo uwagi poświęca się odpowiednim systemom jakości, które muszą być stosowane w każdym miejscu pobierania krwi/osocza, z którego surowiec jest dostarczany do zakładu frakcjonowania. Czynności i zabiegi wykonywane w trakcie pobierania krwi lub osocza mają ogromny wpływ na gotowy produkt leczniczy.

Jednocześnie takie centra muszą być regularnie poddawane urzędowym inspekcjom, prowadzonym przez kompetentne organy, których zadaniem jest kontrola warunków wytwarzania produktów leczniczych zgodnie z wymaganiami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP). Obowiązek regularnego audytowania swoich partnerów (dostawców osocza) spoczywa również na samych zakładach jego frakcjonowania. Przeprowadzane audyty mają służyć uniknięciu jakichkolwiek odstępstw od wzajemnie uzgodnionych (umowy/kontrakty) parametrów jakościowych materiału wyjściowego. Obszary, na które szczególnie należy zwrócić uwagę w kontroli dostawców osocza, to zasady kwalifi kacji i badania dawców, system etykietowania i dokumentowania donacji oraz przechowywanie pobranego materiału.

Dawcy powinni być wybierani zgodnie z zaleceniami Rady Europy i spełniać zalecenia zdrowotne określone właściwymi przepisami. Każda donacja musi być przebadana specyficznymi, zwalidowanymi testami diagnostycznymi w celu ewentualnego wykrycia w niej markerów wirusologicznych - HBs, HIV 1/2, HCV oraz kiły. Indywidualne/pojedyncze donacje muszą dawać wynik ujemny anty-HIV 1/2, anty HCV i HbsAg. Jednocześnie wymagana jest analiza metodami NAT mini pul osocza na obecność wirusów bezotoczkowych, tj. HAV i B 19.

Kontrola surowca
Ważnym elementem bezpieczeństwa osocza są worki do jego pobierania. Należy więc zawsze rejestrować ich producenta, numer serii, rodzaj stosowanych antykoagulantów oraz metody sterylizacji stosowane przy ich wytwarzaniu. Ważnym czynnikiem, mającym ogromny wpływ na zawartość w pobranym osoczu niektórych białek, szczególnie czynnika VIII, jest temperatura. Uzyskiwane osocze określane jako świeże mrożone (Fresh Frozen Plasma - F FP), w czasie 6-8 godzin po pobraniu, musi być poddane temperaturze -20oC; - 25oC; - 30oC (w zależności od wymagań w danym obszarze). Pewien wyjątek stanowi osocze przeznaczone wyłącznie do produkcji albuminy lub immunoglobuliny, które można zamrozić do temperatury – 20^oC w czasie do 72 godzin od jego pobrania. Przygotowany w ten sposób surowiec może być przechowywany w temperaturze - 20^o-C i niższej przez okres od kilku do kilkunastu miesięcy. Powinna być utrzymywana stała temperatura przechowywania i transportu surowca.

Wszystkie warunki przechowywania osocza i dane epidemiologiczne obszaru, z którego pochodzi, stanowią integralną część Dokumentacji Głównej Osocza (PMF – Plasma Master File). Jest ona jednocześnie załącznikiem dokumentacji rejestracyjnej każdego leku osoczopochodnego. Jest to wymagany ustawowo zbiór informacji, który mimo tego, że jest częścią dokumentacji rejestracyjnej stanowi również niezależny dokument. Zakres i rodzaj zawartych w nim danych określają stosowne przepisy. Zawartość Dokumentacji Głównej Osocza (PMF) musi być aktualizowana przez podmiot odpowiedzialny każdego roku bez względu na okres ważności pozwolenia na dopuszczenie produktu do obrotu.

Proces frakcjonowania

Rozpoczęcie wytwarzania/frakcjonowania osocza zgodnie z wymaganiami poprzedza utworzenie puli osocza. Każda donacja wchodząca w jej skład musi być rejestrowana. Typową wielkością puli jest seria 2-4 tys. litrów. Wszystkie dokumenty wraz z próbkami muszą być przechowywane co najmniej przez rok po upływie daty ważności wytworzonych z niej leków. Jednocześnie każda pula musi być badana ponownie przez frakcjonatora w celu upewnienia się, że nie występują w niej ww. wirusy.

Po powolnym rozmrożeniu puli osocza stanowiącej daną serię rozpoczyna się proces technologiczny, w wyniku którego wykonuje się cały szereg zabiegów technologicznych prowadzących do wyizolowania kolejnych frakcji (produktów pośrednich). Mogą być one przechowywane, łączone lub nawet przekazywane do innych zakładów w celu otrzymania gotowych leków. W takim przypadku należy przeprowadzić procesy walidacyjne wszystkich czynności zapewniających bezpieczeństwo wirusologiczne gotowego produktu. Muszą być również przeprowadzone badania stabilności poszczególnych frakcji przechowywanych w danych warunkach. Uzyskane białka poddawane są kolejnym zabiegom – dąży się do osiągnięcia jak największej ich czystości chemicznej przy zachowaniu wysokiej aktywności biologicznej.

Można powiedzieć, że głównymi celami stosowania wyżej wymienionych technik chromatograficznych są uzyskanie jak najwyższej czystości wytwarzanych preparatów, otrzymywanie białek występujących w niewielkich (śladowych) stężeniach, zmniejszenie strat cennych białek – podniesienie wydajności oraz usuwanie z gotowego produktu użytych wcześniej do dezaktywacji wirusów odczynników.

Bezpieczeństwo wirusologiczne
Wytwarzane obecnie leki osoczopochodne muszą być bezpieczne pod względem wirusologicznym. W tym celu stosuje się zgodnie z wymaganiami farmakopealnymi różne techniki i zabiegi dezaktywacji wirusów.

Wszystkie te techniki wymagają walidacji w warunkach wytwarzania u każdego frakcjonatora i mogą też być traktowane jako kolejne etapy procesu technologicznego.

Kontrola międzyoperacyjna
Dużo uwagi w procesie wytwarzania poświęca się działaniom związanym z kontrolą międzyoperacyjną. Od frakcjonatora wymaga się dokładnych opisów używanego sprzętu i urządzeń wraz z technikami próbkowania, i przechowywania próbek pobranego, i badanego materiału. Takie czynności, jak pulowanie osocza, badanie materiałów wyjściowych i markerów wirusologicznych muszą być w pełni zwalidowane. Monitoring istotnych dla procesu technologicznego parametrów, do których należą pH, temperatura, stężenie alkoholu etylowego i kontrola sterylności wraz z badaniem endotoksyn bakteryjnych, muszą być w pełni udokumentowane.

Kontrola jakości gotowych produktów musi spełniać wymagania farmakopealne. Jeżeli wytwórca posługuje się własnymi metodami badania, jest zobowiązany do przeprowadzenia procesu ich walidacji, tak aby udowodnić ich pełną zgodność z opisami Europejskiej Farmakopei.

Poszczególne etapy wytwarzania muszą być zwalidowane i udokumentowane. Bardzo ważne jest udowodnienie skuteczności usuwania niepożądanych składników, takich jak stosowane w procesie środki chemiczne oraz niebezpieczne dla pacjenta naturalne składniki biologiczne, np. związki odpowiedzialne za grupy krwi lub aktywne formy czynników krzepnięcia. Przy stosowaniu technik chromatograficznych należy udowodnić (przy stosowaniu chromatografii powinowactwa), że z kolumn nie są uwalniane niepożądane substancje. Niezwykle istotnym elementem walidacji procesu wytwarzania jest również mycie i dezynfekcja.

W celu uzyskania odpowiedniej jakości i bezpieczeństwa wprowadzanych do obrotu produktów osoczopochodnych istnieje określony odrębnymi przepisami obowiązek poddania ich urzędowemu, wstępnemu zwolnieniu. Koszt badania ponosi producent. Każda wytworzona partia produktu wraz z raportem serii oraz z próbkami przeznaczonymi do badań musi być dostarczona do wyznaczonego przez kompetentny organ urzędowego laboratorium.

Zgodnie z wymaganiami ustawy Prawo farmaceutyczne w Polsce wszystkie produkty krwiopochodne, tj. czynniki krzepnięcia, inhibitory krzepnięcia, kleje fibrynowe, albumina ludzka, immunoglobulina ludzka, osocze przemysłowo-dezaktywowane, muszą być poddane kontroli seryjnej wstępnej, określanej w Unii Europejskiej skrótem OCABR (Official Control Authority Batch Release). Dopiero po uzyskaniu certyfikatu potwierdzającego jakość produktu zgodną z zarejestrowaną jego specyfikacją, wytwórca może wprowadzić lek osoczopochodny do obrotu.

***

Produkty osoczopochodne są obecnie, mimo ich wysokiej ceny, niezbędnymi i czasami wręcz niezastąpionymi lekami w terapii wielu chorób. Dla przemysłu frakcjonującego osocze niekończącym się wyzwaniem jest stałe doskonalenie metod i technik związanych z bezpieczeństwem wytwarzanych preparatów oraz kontynuowanie badań klinicznych pozwalających na rozszerzanie wskazań do ich stosowania w terapii.

Literatura:
[1] Cohn E., Strong L., Hughes W., et al: Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV A system for the separation into fractions of the proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J Am Chem Soc 68: 459475,1946.
[2] Kistler P., Nitschmann H.,: Large-scale production of human plasma fractions. Eight years of experience with the alcohol fractionation procedure of Nitschmann, Kistler and Lergier. Vox Sang 7: 414-424,1962.
[3] Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components – 14th edition (2008); Council of Europe.
[4] Farugia A.: Plasma for fractionation: Safety and quality issues. Haemophilia 10:334-340,2004.
[5] Willkommen H., Schmidt I., Lower J.: Safety issues for plasma derivatives and benefit from NAT testing. Biologicals 27: 325-331,1999.
[6] CPMP Note for guidance on plasma-derived medicinal products (CPMP/BWP/269/95, rev 4).
[7] Council of the European Union Recomendation of 29 June 1998 On the suitability of blood and plasma donors and the screening of donated blood in the European Community (98/463/EC), Official Journal, 1998, L203,14-26.
[8] Ng PK, Dobkin MB.: Pasterization of antihemophilic factor and model virus inactivation studies. Thromb Res 39: 439-447, 1985.
9] Dichtelmuller H., Rudnick D., Kloft M.: Inactivation of lipid enveloped viruses by octanoic acid treatment of immunoglobulin solution. Biologicals 30: 135-142, 2002.
[10] Nowak T., Niedrig M., Bernhardt D. et al: Inactivation of HIV, HBV, HCV related viruses and other viruses in human plasma derivetives by pasteurization. Dev Biol Stand 81: 169-176, 1993.
[11] Foster PR, Welch AG, McLean C, et al: Studies on the removal of abnormal prion protein by processes used in the manufacture of human plasma products. Vox Sang 78: 86-95, 2000.
[12] Burnouf T.: Chromatography in plasma fractionation: benefi ts and future trends. J Chromatogr B Biomed Appl 664: 3-15, 1995.
[13] Burnouf T., Burnouf-Radosevich M., Huart JJ, et al A highly purifi ed factor VIII:c concentrate prepared from cryoprecipitate by ion-exchange chromatography. Vox Sang 60: 8-15, 1991.
[14] Commission Directive 2003/63/EC of 25 June 2003 amending Directive 2001/83/EC of European Parliment and Council on the Community code relating to medicinal products for human use.

Autor: Krzysztof Łysakowski, BIOMED LUBLIN Wytwórnia Surowic i Szczepionek S.A.
Artykuł został opublikowany w magazynie "Przemysł Farmaceutyczny" nr 4/2011
Źródło fot.: www.sxc.hu